视神经炎是一种急性自限性疾病，可引起视力下降，大部分病人几周后可以自行恢复。然而，在视神经炎实验治疗组中，大约有40％的病人发生一定水平的永久性的视力降低.随后的研究显示视网膜神经纤维层变薄，标记表明RGC轴突减少，这就说明了视神经炎发生后视力的降低[2，3]。有些MS患者没有发生视神经炎，但由于视网膜神经纤维层变薄也可导致相应的视力下降,这表明在此类疾病中RGC轴突的减少是视力降低的主要原因。MS和EAE的研究表明轴突损伤和神经元的丢失是产生永久性神经学功能障碍的主要因素，这些研究结果是一致的。神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）是神经营养因子家族中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子；是维持中枢神经和周围神经功能的重要活性因子。由于NGF对神经细胞具有营养和保护作用，临床工作者开始研究用NGF来治疗视网膜和视神经疾病。越来约多动物实验证明，NGF对视网膜缺血性损害、遗传性视网膜色素变性、视神经损伤有明确疗效，对视网膜神经节细胞有很好的保护作用。基于以上研究结果，我们认为NGF对于脱髓鞘性视神经炎视功能的降低可能有一定的治疗价值。本研究通过玻璃体注射外源性鼠神经生长因子，观察其对小鼠视神经炎视网膜神经组织的保护作用,为探索对具有保护作用的药物提供一定的实验依据。1、材料和方法1.1实验材料实验动物：实验用C57BL/6（H-2b）小鼠，雌雄不限，8－10周龄，由中国人民解放军总医院实验动物中心提供。动物饲养于室温24士2℃的环境中，维持光一暗12小时循环交替，并给予充足的食料和洁净饮水。饲养2一7天后，用于实验。主要试剂：鼠源MOG35－55多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）：由北京赛百盛基因技术有限公司合成，采用反高校液相色谱仪（C18柱）分离钝化，纯度在95％以上。完全弗氏佐剂（CFA）：购自美国Sigma公司；百日咳菌苗和结核杆菌冻干粉均购自北京天坛生物制品研究所。注射用鼠神经生长因子（1.5mg/ml）购自舒泰神药业有限公司。2.方法2.1实验动物分组：50只C57BL/6小鼠随机分为3组：CON组10只、BSS+EAE组和NGF+EAE组各20只，实验动物由本院实验动物中心提供。2.2EAE模型的建立及神经功能评分：将300ugMOG35-55溶于200ulPBS液再与200ulCFA混合，添加结合杆菌使其终浓度为2mg/ml,用电子搅拌棒冰浴下搅拌5－10分钟达到充分乳化。最终需鉴定是否乳化完全，方法是将一滴乳剂滴入水中，如不散开漂在水面则为乳化完全；如立即散开，则未乳化充分。尽量在避光、低温、无菌条件下操作。EAE组双侧腹壁分四点皮下注射混合乳剂，对照组直接将200ulPBS液和200ulCFA充分乳化后分双侧腹壁分四点皮下注射。两组均于免疫前24小时和免疫后24小时每只小鼠腹腔注射100ul百日咳菌液（含活菌2×109个）。每天由观察者记录每只小鼠的体重并进行神经功能评分，直至免疫后的30天。神经功能评分：0分：无临床症状；1分：尾部张力降低或轻度步态笨拙；2分：尾部无张力或中度步态异常，双后肢无力,被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪,被动翻身后不能恢复,但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪,前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；5分：濒死状态或死亡。2.3玻璃体腔注射将小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠0.15ml，麻醉后固定于实验台上，滴复方托品酰胺散瞳，手术显微镜下用5ul微量注射器于颞上象限角膜缘后0.5mm处刺入眼球壁，然后倾斜进入玻璃体腔，缓慢注射3ug/2ulNGF于NGF+EAE组小鼠玻璃体腔，针尖在玻璃体腔内停留20秒后缓慢抽出，结膜囊内涂金霉素眼膏。BSS＋EAE组只注射BSS溶液2ul,余处置同前，在免疫后的第4天和第10天分别对两组小鼠进行玻璃体注射。2.4视觉电生理检查根据我们对小鼠视神经炎模型病程中视觉电生理的监测，f-VEP和f-ERG的改变先于临床症状的发生，因此我们选择免疫后的第7天和第14天各取10只小鼠（20眼）进行f-VEP和f-ERG检查，以评价NGF的治疗效果。2.5视神经组织形态学观察在免疫后第7天和第14天各组小鼠做完f-VEP、f-ERG检查后用4％的多聚甲醛经心脏灌注，钝性分离取出视神经和眼球。对视神经采用HE染色、LuxolFastBlue髓鞘染色、Bielschowsky银染分别评估炎性细胞浸润、髓鞘脱失程度和轴突病理改变。2.6视网膜神经节细胞凋亡的检测取视网膜做石蜡切片，使用原位细胞凋亡（TUNEL）检测其视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡。显微镜下观察，TUNEL阳性表达为细胞核呈棕黄色染色。每个标本取三张切片，400倍下每张切片随机取5个视野计数TUNEL染色阳性的RGCs，分别计算凋亡指数（AI），AI＝凋亡细胞数/细胞总数×100％，取其平均值为该例标本凋亡指数。2.7统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析。对数据进行正态性检验后用t检验的方法分析，实验数据采用均数±标准差(x±s)表示。3.结果3.1MOG35－55免疫小鼠EAE发病情况、体重变化和功能评分两组患病小鼠均表现为精神萎靡、体重下降、尾无力下垂，后肢或四肢麻痹、大小便失禁。BSS＋EAE组小鼠EAE平均发病时间为14.4±2.48d，NGF＋EAE组小鼠EAE平均发病时间为16.1±1.48d，可见NGF＋EAE组发病潜伏期有延长趋势，但统计学分析无显著性意义（p0.05）。临床症状的评分(图1)在发病当天两组相似：NGF组平均临床评分0.6±0.
1，对照组平均临床评分0.7±0.1。统计学比较无显著性差异（p0.05）。图1-1小鼠免疫后的每个时间点平均神经功能评分3.2视觉电生理检查我们在免疫后的第7天和第14天对小鼠进行f-VEP和f-ERG的检查，结果见（表2－1）。EAE组每眼各波结果在正常值范围之内认为没有改变。f-VEP的变化（表1－1）:在p.i.7d,所有动物均可引出清晰的VEP波形，NGF+EAE组有较好的VEP结果，统计学分析LN1、LP、AP和BSS+EAE组相比无显著性差异（P0.05）。在p.i.14d，NGF+EAE组和BSS+EAE组f-VEP的结果相似：NGF+EAE组有10眼VEP发生改变，其中5眼未引出波形；BSS+EAE组有12眼VEP发生改变，其中6眼未引出波形。我们对VEP改变有波形眼进行统计学比较，LN1、LP和AP两组均无显著性差异(P0.05)。表1－1NGF+EAE组与BSS+EAE组不同时间点f-VEPP波潜伏期的变化（x±s，ms）LN1(ms)LP(ms)AP(mv)i.d.0d(n=20)CON52.70±2.0672.15±2.3346.25±1.74BSS+EAE53.20±0.9272.03±1.1943.63±2.10NGF+EAE53.18±1.0871.00±1.0042.61±2.13i.d.7dCON（n=10）53.55±1.3060.30±1.6942.04±2.37BSS+EAE(n=7)65.43±8.2772.35±0.6315.99±4.88*NGF+EAE(n=5)62.4±7.3888.07±12.16*19.12±7.16*i.d.14dCON（n=10）53.50±1.1373.70±1.0640.70±1.60BSS+EAE(n=6)107.83±24.27*137.33±21.98*7.43±3.16*NGF+EAE(n=5)105.4±26.39*135.4±26.50*6.16±2.96*与CON相比,*p≤0.05;和BSS+EAE相比,▲p≤0.05;EAE组n为记录结果超出正常值范围的眼的数目f-ERG的变化（表1－
2，图2－1，图2－2）：为了研究NGF对RGCs的电生理功能的影响,我们对各组小鼠不同时间点进行f-ERG检查。在p.i.7d,BSS+EAE组和NGF+EAE组各有6眼和5眼，其a波,b波潜伏期有延长趋势，幅值降低，超出正常值范围，但统计后两组比较无显著性差异（P0.05）；在p.i.14d，NGF+EAE组有较好的结果，NGF+EAE组3/20眼未引出波形，6/20眼各波潜伏期和幅值超过正常值范围；BSS+EAE组6/20未引出波形，7/20眼各波潜伏期和幅值超过正常值范围。我们对两组结果进行分析，NGF+EAE组ERG改变眼b波潜伏期、幅值和BSS+EAE组比较有缩短趋势，差异有显著性意义（P0.05）。表1－2NGF+EAE组与BSS+EAE组不同时间点ERG的变化（x±s）La(ms)Aa(mv)Lb(ms)Ab(mv)i.d.0d(n=20)CON21.80±0.95115.30±8.6660.90±1.05459.70±9.75BSS+EAE22.15±0.80129.32±8.1161.20±1.28458.75±20.89NGF+EAE22.50±0.71134.36±8.9661.03±1.08466.72±16.11i.d.7dCON（n=10）21.80±1.09122.98±7.8760.30±1.69457.17±11.67BSS+EAE(n=6)43.33±3.40*51.04±16.11*88.58±7.07*133.12±29.87*NGF+EAE(n=5)43.15±2.32*49.94±13.37*89.50±6.49*136.59±23.47*i.d.14dCON（n=10）21.35±1.226120.36±9.1460.15±1.44454.93±13.49BSS+EAE(n=6)49.25±4.61*39.33±23.69*125.00±10.64*83.21±48.89*NGF+EAE(n=7)45.2
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