一、艾滋病病毒体外存活时间 体外生存 在人体外生存能力极差,不耐高温,抵抗力较低,离开人体不易生存,常温下,在体外的血液中只可生存数小时(hours),对热敏感,在56℃条件下30分钟即失去活性,且病毒在离开体外的瞬间失去传染性,日常生活接触不会感染。
灭活方法 不加稳定剂时,病毒在-70℃冰冻下失去活性;而添加35%山梨醇或50%胎牛血清,在-70℃时冰冻3个月仍保持活性。
对消毒剂和去污剂亦敏感,0.2%次氯酸钠、0.1%漂白粉、70%乙醇、35%异丙醇、50%乙醚、0.3%H2O2 0.5%来苏尔处理5分钟能灭活病毒,1%NP-40和0.5%triton-X-100能灭活病毒而保留抗原性。
对紫外线、γ射线有较强抵抗力。 国际卫生组织推荐对艾滋病病毒灭活加热100℃持续20分钟,效果较理想。艾滋病病毒的消毒主要是针对被艾滋病病毒感染者和艾滋病病人的血液、体液污染的医疗用品、生活场所等。
例如,辅料、纱布、衣物等。对艾滋病病毒的消毒可以根据消毒物品选择适当的物理方法或化学方法。需要重复使用的物品可用煮沸或高压蒸汽消毒。
不宜煮沸的物品可用2%戊二醛、75%酒精等进行消毒。 体液生存 室温下,在实验室严格控制的组织培养液的环境中的HIV可以存活15天。
一些研究机构证明 ,离体血液中HIV的存活时间决定于离体血液中病毒的含量,病毒含量高的血液,在未干的情况下,即使在室温中放置96小时,仍然具有活力。
即使是针尖大小一滴血,如果遇到新鲜的淋巴细胞,艾滋病毒仍可在其中不断复制,仍可以传播。 病毒含量低的血液,经过自然干涸2小时后,活力才丧失;而病毒含量高的血液,即使干涸2-4小时,一旦放入培养液中,遇到淋巴细胞,仍然可以进入其中,继续复制。
但这些情况仅仅限于实验室环境下。 据美国cdc报告,即使是实验室环境,实验室中用于实验的比人体血液和体液浓度高得多的病毒,在干燥几小时后,活性下降百分之九十九。
因此,除实验室环境外,含有HIV的离体血液造成感染几率几乎为零。HIV不能在空气中、水中和食物中存活,在外界这些病毒会很快死亡,即使在含有HIV的血液和其它体液中。
不在实验室环境或者不在密闭环境(比如针筒、针头)中,HIV是无法保持活性的。必须指出,在用过的注射针头的残留血液里,HIV可以存活比较长的时间,使用针头可以直接进入人体的血液,因此,使用过的注射针头很具有HIV传染的危险性,用过的注射针头绝对不可重复使用。
美国相关科学研究部门经过近百万次除外明确传播途径的特殊情况接触暴露实验所得的结果:被感染案例不到万分之一。二、艾滋病病毒的检测方法 检测HIV感染者体液中病毒抗原和抗体的方法,操作方便,易于普及应用,其中抗体检测尤普通。
但HIv P24抗原和病毒基因的测定,在HIV感染检测中的地位和重要性也日益受到重视。 抗体检测 血清中HIV抗体是判断HIV感染的间接指标。
根据其主要的适用范围,可将现有HIV抗体检测方法分为筛检试验和确证试验。 确证试剂 筛检实验阳性血清的确证最常用的是Western blot(WB),由于该法相对窗口期较长,灵敏度稍差,而且成本高昂,因此只适合作为确证实验。
随着第三代和第四代HIV诊断试剂灵敏度的提高,WB已越来越满足不了对其作为确证实验的要求。 FDA批准的另一类筛检确证试剂是-免疫荧光-试验(IFA)。
IFA比WB的成本低,而且操作也相对简单,整个过程在1-1.5小时内即可结束。此法的主要缺点是需要昂贵的荧光检测仪和有经验的专业人员来观察评判结果,而且实验结果无法长期保存。
现在FDA推荐在向WB不能确定的供血员发布最终结果时以IFA的阴性或阳性为准,但不作为血液合格的标准。 筛检试验 筛检试验主要用于对供血员进行筛查,因此要求操作简便,成本低廉,而且灵敏、特异。
2012年,世界上主要的筛检方法仍然是ELISA,还有少数的颗粒凝集试剂和快速ELISA试剂。ELISA有很高的灵敏度和特异性,操作简单,仅需要实验室配备酶标仪和洗板机即可应用,特别适合于试验室大规模筛检使用。
颗粒凝集实验是另一种操作简单方便,成本低廉的检测方法,该方法结果可通过肉眼判定,灵敏度很高,特别适合发展中国家或大量筛选供血员时使用,缺点是必须使用新鲜样品,特异性较差。
80年代后期发展起来的斑点印迹检测(Dot-blot assay)是一种快速ELISA(Rapid ELISA)方法,这种方法操作极为简便,过程短暂,整个过程多数在5-10分钟内甚至3分钟内即可结束,但该法比ELISA和颗粒凝集试剂昂贵得多。
人类免疫缺陷病毒抗体口腔粘膜渗出液检测试剂盒(胶体金法)就属于侧向免疫层析法(金免疫)类别,基于免疫层析技术通过手工操作、肉眼读取结果、20分钟即可定性得出检测结果的快速诊断试剂,用于检测口腔粘膜渗出液样本中的HIV-1型和HIV-2型抗体。
可用于自愿咨询检测、不愿采血、晕针患者的初筛。该方法适用于初筛检测,凡由该试剂测定为阳性者,需进行进一步筛查确认。
[HIV阴性]说明从人体内检测不到HIV抗体,阴性符号以(-)表示。不能说没有感染HIV, 要看是什么时候检测的,在窗口期内,感染者的体内还没有产生HIV抗体,或还没有产生足量的HIV抗体,这时HIV检测是阴性结果,如果在窗口期之后检测的,可以排除感染HIV的可能。
[HIV阳性]说明从人体内检测到了HIV抗体,阳性符号以(+)表示。 [检测结果不定因素] 感染还处于窗口期:从HIV进入体内到检测这段时间还不够长,因此血清还没有形成典型的抗体反应 艾滋病进展到终末期,抗体水平下降 其他非病毒蛋白抗体的交叉反应:自身免疫性疾病、某些恶性疾病、怀孕、输血或器官移植等情况下,身体可以产生一些抗体,其反应与HIVP24核心蛋白抗体引起的反应很相似 抗原检测 病原检测主要指用病毒分离培养、电镜形态观察、病毒抗原检测和基因测定等方法从宿主标本中直接检测病毒或病毒基因。
由于前两种方法难度大,且需要特殊设备和专业技术人员。因此仅抗原检测和RT-PCR(反转录-PCR)可用于临床诊断。
HIV-1P24抗原检测可用于HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断;HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断;第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性,但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断。
P24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂,试剂必须经过SDA批准注册、在有效期内,其阳性结果必须依据试剂说明书经中和试验确认。
HIV-1P24抗原检测的敏感性为30-90%,该结果仅作为HIV感染的辅助诊断依据,不能据此确诊;HIV-1 P24抗原检测阴性只表示在本试验中无反应,不能排除HIV感染,临床中一般不作为常规诊断项目。
核酸检测 HIV核酸检测可用于HIV感染的辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效判定、预测疾病进展等。常用的HIV病毒载量检测方法包括逆转录PCR实验(RT-PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)以及实时荧光定量PCR技术。
值得注意的是,每一种HIVRNA定量系统都有其最低检测限,即可以测出的最低拷贝数或国际单位,RNA定量检测时未测出不等于样品中不含有病毒RNA,因此HIV核酸定性检测阴性,只可报告本次实验结果阴性,但不能排除HIV感染;HIV核酸检测阳性,可作为诊断HIV感染的辅助指标,不能单独用于HIV感染的诊断。
报告HIV核酸定量检测结果时应按照仪器读数报告结果,注明使用的实验方法、样品种类和样品量,当测定结果小于最低检测限时,应注明最低检测限水平。
HIV核酸定性检测也可用于HIV感染的辅助诊断,在分析HIV基因亚型和变异等基础研究中应用。通常使用PCR或RT-PCR技术,使用分子生物学实验室通用的扩增试剂,引物可来自文献或自行设计,应尽量复盖所有或常见的毒株,也可使用复合引物。
报告定性检测结果时应注明反应条件和所使用的引物序列。此外,利用核酸检测方法的高度敏感性,使用集合核酸扩增检测技术和方法,对高度怀疑感染人群且抗体阴性的样品进行集合核酸检测,可及时发现窗口期感染者。
该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。三、艾滋病的传染方法 传播途径 HIV感染者是传染源,曾从血液、精液、阴道分泌液、乳汁等分离得HIV。
握手,拥抱,接吻,游泳,蚊虫叮咬,共用餐具,咳嗽或打喷嚏,日常接触等一般不会传播。 [性接触传播]HIV存在于感染者精液和阴道分泌物中,性行为很容易造成细微的皮肤粘膜破损,病毒即可通过破损处进入血液而感染。
无论是同性还是异性之间的性接触都会导致艾滋病的传播。艾滋病感染者的精液或阴道分泌物中有大量的病毒,在性活动(包括阴道性交、肛交和口交)时,由于性交部位的摩擦,很容易造成生殖器黏膜的细微破损,这时,病毒就会趁虚而入,进入未感染者的血液中。
值得一提的是,由于直肠的肠壁较阴道壁更容易破损,所以肛门性交的危险性比阴道性交的危险性更大。 [血液传播]人体被输入含有HIV的血液或血液制品、静脉吸毒、移植感染者或病人的组织器官都有感染艾滋病的危险性。
[母婴传播]感染了HIV的妇女在妊娠及分娩过程中,也可将病毒传给胎儿,感染的产妇还可通过母乳喂养将病毒传给吃奶的孩子。
致病机制 HIV选择性的侵犯带有CD4分子的,主要有T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。细胞表面CD4分子是HIV受体,通过HIV囊膜蛋白gp120与细胞膜上CD4结合后,gp120构像改变使gp41暴露,同时gp120-CD4与靶细胞表面的趋化因子CXCR4或CXCR5结合形成CD4-gp120-CXCR4/CXCR5三分子复合物。
gp41在其中起着桥的作用,利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合。最终造成细胞被破坏。其机制尚未完全清楚,可能通过以下方式起作用: 1.由于HIV包膜蛋白插入细胞或病毒出芽释放导致细胞膜通透性增加,产生渗透性溶解。
2.受染细胞内CD-gp120复合物与细胞器(如高尔基氏体等)的膜融合,使之溶解,导致感染细胞迅速死亡。 3.HIV感染时未整合的DNA积累,或对细胞蛋白的抑制,导致HIV杀伤细胞作用。
4.HIV感染细胞表达的gp120能与未感染细胞膜上的CD4结合,在gp41作用下融合形成多核巨细胞而溶解死亡。
5.HIV感染细胞膜病毒抗原与特异性抗体结合,通过激活补体或介导ADCC效应将细胞裂解。 6.HIV诱导自身免疫,如gp41与T4细胞膜上MHCⅡ类分子有一同源区,由抗gp41抗体可与这类淋巴细胞起交叉反应,导致细胞破坏。
7.细胞程序化死亡(programmed cell death ):在艾滋病发病时可激活细胞凋亡 (Apoptosis) 。
如HIV的gp120与CD4受体结合;直接激活受感染的细胞凋亡。甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞,通过细胞表面CD4分子交联间接地引起凋亡CD+4细胞的大量破坏,结果造成以T4细胞缺损为中心的严重免疫缺陷,患者主要表现:外周淋巴细胞减少,T4/T8比例配置,对植物血凝素和某些抗原的反应消失,迟发型变态反应下降,NK细胞、巨噬细胞活性减弱,IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。
病程早期由于B细胞处于多克隆活化状态,患者血清中lg水平往往增高,随着疾病的进展,B细胞对各种抗原产生抗体的功能也直接和间接地受到影响。
艾滋病人由于免疫功能严重缺损,常合并严重的机会感染,常见的有细菌(鸟胞内分枝杆菌复合体,MAI)、原虫(卡氏肺囊虫、弓形体)、真菌(白色念珠菌、新型隐球菌)、病毒(巨细胞病毒、单纯疱疹病毒,乙型肝炎病毒),最后导致无法控制而死亡,另一些病例可发生Kaposis肉瘤或恶性淋巴瘤。
此外,感染单核巨噬细胞中HIV呈低度增殖,不引起病变,但损害其免疫功能,可将病毒传播全身,引起间质肺炎和亚急性脑炎。
艾滋病病毒进入人体后,首先遭到巨噬细胞的吞噬,但艾滋病病毒很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境,创造了适合其生存的条件,并随即进入T-CD4淋巴细胞大量繁殖,最终使后一种免疫细胞遭到完全破坏。
HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体,其中艾滋病病人水平最低,HIV携带者最高,说明该抗体在体内有保护作用。
但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触,且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异,原有抗体失去作用,使中和抗体不能发挥应有的作用。
在潜伏感染阶段,HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中,因此HIV不会被免疫系统所识别,所以单单依靠自身免疫功能无法将其清除。
四、艾滋病的有效治疗 1.抗病毒治疗 已批准生产的有三大类共14种化学治疗药物。包括5种核苷类逆转录酶抑制剂(NPT1)、3种非核苷类逆转录酶抑制剂(N-NRT1)及6种蛋白酶抑制剂(P1):齐多夫定(zidovudine,ZDV,AZT)、去羟肌苷(didanasine,ddl)、扎西他滨(zal-citabine,ddC)、司他夫定(stavudine,d4T)、拉米夫定(lamivudine,3TC)、奈韦拉平(nevirapine)、台拉韦定(delavintine,rescriptor,DLV)、依非韦伦(efavirem)、英地那韦(indlnavir,IDV)、里托那韦(ritonavir,RTV)、沙奎那韦(saquinavir,SAQ)、fortovase、奈费那韦(nelfmavir,NVP)、amprenavir。
1.核苷类逆转录酶抑制剂 此类药物能选择性与HlV逆转录酶结合,并掺入正在延长的DNA链中,使DNA链中止,从而抑制HIV的复制和转录。
此类药物包括齐多夫定(Zidovudin,AZT),常用剂量500 mg/d;双脱氧胞苷(dideoxycylidine,ddc),0.75mg,kg/d;双脱氧肌苷,(dideoxyinosine,ddD200～400mg/d;拉米夫定(1amivudine,3TC),150 mg/d和司他夫定(stav~,dine,d4T),80 mg/d。
2.非核苷类逆转录酶抑制剂 其主要作用于HIV逆转录酶的某个位点,使其失去活性,从而抑制HIV复制。由于此类药物不涉及细胞内的磷酸化过程,因而能迅速发挥抗病毒作用,但也易产生耐药株。
主要制剂有奈非雷平(nevirapine),1600 mg/d;loviride,300 mg/d和delavirdin,1200 mR,d。
3.蛋白酶抑制剂 它能通过抑制蛋白酶即阻断HIV复制和成熟过程中所必须的蛋白质合成,从而抑制HIV的复制。
此类制剂包括沙奎那韦(~quinavir-),800 mg/d;英地那韦(indinavir),1600 mg/d;奈非那韦(nelfinavir·)。
2250 mg/d和利托那韦(riton-avir),200 mg do 实践证明联合治疗能延缓AIDS发病和延长病人生命。
联合治疗的疗程是HIV一:RNA达到检测水平以下后,继而用二种药物,持续终生治疗,以抑制HIV从潜伏感染的细胞中复制和维持症状的持续缓解。
2.条件致病性感染治疗:卡氏肺囊虫病,可用复方新诺明(TMP/SMZ)每日20~100mg/kg,分4次服用;或羟乙基磺酸戊双脒(pentamidine isothionate)每日4mg/kg,肌肉注射或静脉滴注。
上述药物可单用或联合使用。 3.肿瘤治疗:Kaposi肉瘤可试用α一干扰紊等免疫调节剂,同时采用放射治疗、化学治疗。
4.免疫调节剂:目前应用的免疫增强剂有白细胞介素-2、胸腺肽、香菇多糖等。亦有用胸腺移植、骨髓移植等治疗。增强免疫治疗常和抗病毒治疗合用。
5.联合治疗:应用2种逆转录酶抑制剂和1种蛋白酶制剂的三联疗法可取得最佳疗效。 目前我国的医疗资源有限,只有部分药物可以应用,特别是免费治疗药品选择方案有限。
抗病毒治疗方案是复杂的,应在专家或有经验的医师指导下进行。治疗方案不是绝对的,建议药物配伍应包括两种核苷类药物的至少三联药物,或再加上一种蛋白酶抑制剂或融合抑制剂。
两种核苷类药物不能单独用于抗病毒治疗,因其不能有救充分抑制HIV的复制并有可能产生耐药。治疗时机争议较大,要总体评估病毒抑制和药物副反应带来的利弊与得失,总体趋势更加保守。
一般认为无症状但CD4细胞低于350个/μl或有症状的HIV感染者均应进行HAART治疗,CD4细胞计数快速下降或高病毒载量(>100 000/μl)者可以考虑早期治疗,对依从性不好或可能存在药物副反应高风险(如肝脏疾病患者)者,等CD4降至200个/μl时开始治疗可能合适。
对有某些并发症患者的抗病毒治疗,应先对其并发症进行处理,如并发结核时应先对结核进行抗结核治疗,待病情稳定且无抗结核药物副反应发生时才能开始HAART治疗。
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